Der Darsteller und Schauspieler Sean Murray spielt den Geek des Teams. Als Experte für IT und Datenverarbeitung wird er auch liebevoll McGeek genannt, angelehnt an den Namen der Rolle des Special Agent Timmothy McGee. Aus diesem Grunde ist er gerne einmal das Opfer von freundschaftlich gemeinten Mobbing-Attacken seitens Anthony Dinozzo. Bereit in der Mutterserie JAG spielte Murray den wiederkehrenden Charakter des Danny Walden. Der ehemalige Produzent der Serie Donald P. Bellisario ist sein Stiefvater was ihm wohl auch die Chance gab, sich als McGee zu beweisen.
Brian Dietzen stellt den Autopsie-Gremlin Jimmy Palmer dar. Als Assistent von Dr. Mallard ist er stets für einen lockeren Spruch zu haben, durch die er des öfteren einen schiefen Blick von Gibbs bekommt. Seit Staffel 10 ist er offiziel ein Hauptdarsteller der Serie.
Der Darsteller Rocky Carroll spielt den NCIS Direktor Leon Vance. Er übernahm diese Rolle ab der 6. Staffel durch den Tod von Direktorin Jenny Shepard. Als direkter Vorgesetzter hat er so manchmal seine Probleme mit Special Agent Gibbs.
David McCallum, der Darsteller des Gerichtsmediziners Donald Mallard, auch Ducky genannt, ist die weise Seele des Teams. Diesem steht er mit Rat und Tat jederzeit zur Seite. Mit den Toten zu sprechen ist sein Merkmal.
Diona Reasonover spielt Kasie, die derzeitige NCIS-Forensik-Spezialistin und eine graduierte Studentin an der medizinischen Fakultät von New York. Sie wurde nach dem Weggang von Pauley Perrettes Abby Sciutto zu einem Hauptdarsteller.
Wilmer Valderrama spielt Nick, einen langjährigen Undercover-Agenten, der sich dem Major Case Response Team anschließt, nachdem seine Tarnung aufgeflogen ist. Er ist vor allem für die Rolle des „Fez“ in der Sitcom That ’70s Show bekannt. Er ist auch in der Serie From Dusk till Dawn: The Series, Handy Manny und als Moderator von MTVs Yo Momma aufgetreten.
Jessica Knight, gespielt von Katrina Law, ist eine Agentin der Enforcement Action Capabilities Training Team (REACT). Im Zuge der Serie wird sie Mitglied des NCIS Teams.
Mark Harmon übernimmt den Charakter des Special Agent Leroy Jethrow Gibbs in der TV Serie Navy CIS. Er diente beim US Marine Corps und vertraut meistens auf seinen Instinkt. Innerhalb des Teams spielt er den Teamleiter und übernimmt zugleich die Vaterrolle. Geboren 1951 in Los Angeles studierte er, spielte Football in der NFL und wurde u.a. für sein Rolle in Chicago Hopes bekannt. Der Darsteller wurde 1986 zum Sexiest Man Alive gekührt und spielt seit 2003 den Special Agent Leroy Jethro Gibbs..
Emily Wickersham spielt seit Ende 2013 die ehemalige NSA-Analystin Elleanore Bishop, welche nach dem Ausscheiden von Cote de Pablo den Platz der Ziva David im Team auffüllt. 1984 in Kansas geboren ergatterte Emily Wickersham kleinere Rollen z.B. in der Serie Sopranos oder im Spielfilm „Ich bin Nummer Vier“.
Schauspielerin Maria Bello spielt Dr. Jack Sloane, eine leitende Spezialagentin des NCIS und Betriebspsychologin, die sich auf die Erstellung von Profilen spezialisiert hat. Sie gehört seit der 15. Staffel zur Besetzung und erhielt für ihre Rollen in The Cooler und A History of Violence Golden Globe-Nominierungen.
Die Schauspielerin Cote de Pablo übernahm ab der 3. Staffel von Navy CIS die Rolle der Mossad Agentin Ziva David. Durch ihre strenge und harte militärische Ausbildung hatte sie schnell den Ruf als furchtlosen Killer innerhalb des Teams weg. Mit der Zeit offenbart sie aber zahlreiche weitere Facetten ihres Charakters.
Schauspieler Michael Weatherly spielt den Special Agent Anthony Dinozzo, welcher durch seine kindische Art öfters die Nerven der restlichen Teammitglieder auf die Probe stellt. Als Darsteller wirkte Michael Weatherly unter anderem schon der in Erfolgsserie Dark Angel mit.. Unter Anderem ist er Sänger und Produzent, seit Neustem mit seiner eigenen Produktstionfirma „Solar Drive Productions“. Weatherly war seit der ersten Minute an in der Stammbesetzung von NCIS.
Die Schauspielerin Pauley Perrette spielt die, auf den ersten Blick, etwas merkwürdige Abby Sciuto, eine Expertin auf dem Gebiet der Forensik. Ihr Labor ist ihr Zuhause. Sie kleidet sich im Goth-Style und hört gerne laute Musik während der Arbeit.
Sasha Alexander spielte in den ersten zwei Staffeln den Special Agent Kate Todd. In der ersten Folge von Navy CIS (NCIS) trifft sie, zu der Zeit noch Mitglied des Secret Service, auf Gibbs, welcher sie später rekrutiert.
Lauren Holly war die Direktorin des NCIS. Am Ende der 5. Staffel schied die Darstellerin aus. Zu früheren Zeiten war sie die Partnerin von Gibbs, wodurch es ab und an zu knisternden Situationen zwischen den Beiden kommt.